Эмбриология

ОТБОР СПЕРМАТОЗОИДОВ
В ЧАШКАХ PICSI

Использование чашки для PICSI основано на документальных исследованиях о том, что зрелые и морфологически нормальные сперматозоиды связываются с гиалуронатом.

Для спермы со слабой связывающей способностью с гиалуронатом при проведении данного теста отмечено значительное увеличение показателя клинических беременностей при использовании PICSI-чашек для последующего проведения процедуры ИКСИ.

  • Стерильная чашка сделана из полистирена и содержит 3 микрокаплигиалуроната

  • Предварительно обработанную сперму добавляют в область капли с гиалуронатом, акросома сперматозоида «приливпает» к поверхностигиалуроната через несколько минут

  • Для отборанужного сперматозоида из микрокапли используются обычные микроиглы для проведения процедуры ИКСИ

Использование связанных с гиалуронатом сперматозоидов обеспечивает проведение ИКСИ сперматозоидами, при оплодотворении которыми эмбрионы имеют максимальный потенциал имплантации, что приводит к росту результативности процедуры ИКСИ.

Данная процедура может быть рекомендована пациентам с неоднократными неудачными попытками проведения ИКСИ со стандартной методикой отбора сперматозоидов в предыдущих попытках.
С её стоимостью Вы можете ознакомиться в разделе «Прайс-лист».

Регистрационные документы

Регистрационное удостоверение № ФСЗ 2011/10027

Эмбриология

ЭКО – с точки зрения эмбриолога ЭКО не является «искусственным оплодотворением», поскольку все этапы данной процедуры являются воспроизведением процесса естественного оплодотворения в искусственных условиях. Условия инкубатора и специальные среды для культивирования, в данном случае, выполняют роль маточных труб и их содержимого. Оплодотворение происходит естественным путем - проникновением сперматозоида через оболочку яйцеклетки в ее цитоплазму.

Эмбриологические этапы процедуры ЭКО

1. Пункция фолликулов.


На данном этапе эмбриолог осматривает фолликулярную жидкость (содержимое фолликулов) на наличие яйцеклеток (Рис. 1), которые представляют собой комплекс, состоящий из клеток кумулюса (а), клеток «лучистой короны» (b) и непосредственно яйцеклетки (с). При этом два слоя (a и b) выполняют питательную и защитную функции для яйцеклетки. Полученные при пункции яйцеклетки эмбриолог помещает в «среду оплодотворения», предварительно подготовленную для культивирования в специальной посуде (чашка Петри или планшет) и помещенную в инкубатор.
Рис.1.


Посуда для культивирования маркируется индивидуальными данными супружеской пары и количеством полученных яйцеклеток.

2. Обработка спермы.

После проведения пункции фолликулов супруг пациентки сдает сперму в специально промаркированный идентификационными данными супружеской пары стерильный контейнер. Затем данный образец эякулята оценивается по показателям, установленным для проведения спермограммы, обрабатывается по стандартной методике методом центрифугирования в стерильной пробирке и осаждения подвижных сперматозоидов. Окончательным этапом обработки спермы является ее подготовка к оплодотворению яйцеклеток, заключающаяся в добавлении к осадку подвижных сперматозоидов в пробирке оптимального количества среды для их всплытия. Пробирка с подготовленным образцом спермы помещается в штатив при комнатной температуре до момента оплодотворения.

3. Оплодотворение.

Оплодотворение проводится эмбриологом в установленное время путем добавления из пробирки с помощью специального дозатора со стерильным наконечником суспензии подвижных сперматозоидов в «среду оплодотворения» с яйцеклетками. При этом в зависимости от показателей спермограммы количество сперматозоидов может варьировать от 25 тысяч до 100 тысяч на одну яйцеклетку. Затем яйцеклетки (в промаркированной посуде) помещаются в инкубатор до момента оценки признаков оплодотворения.

4. Оценка оплодотворения.

Рис.2.

Наличие признаков оплодотворения эмбриолог осуществляет под микроскопом через 16-20 часов после проведения процедуры оплодотворения (1 день культивирования). При этом заполняется специальный протокол, в котором отмечаются особенности оплодотворения каждой яйцеклетки индивидуально. Для детального осмотра яйцеклеток их специальными микроинструментами очищают от клеток короны и кумулюса и переносят в чашки с индивидуальными каплями «среды дробления». Признаками нормального оплодотворения является наличие в цитоплазме оплодотворенной яйцеклетки двух образований круглой формы, называемых пронуклеусами (Рис.2).

Рис.3а Рис.3b Рис.3c

Следует знать, что при пункции не все полученные яйцеклетки могут быть зрелыми, и, следовательно, могут не оплодотвориться. Помимо зрелых яйцеклеток существует еще две стадии их развития – незрелые и недозревшие. Незрелая яйцеклетка имеет в цитоплазме «зародышевый пузырек» (Рис.3а), в процессе созревания он рассасывается и в недозревшей яйцеклетке не виден (Рис. 2b). О зрелости яйцеклетки говорит появление образования, называемого «первым полярным телом» (Рис 3.с)

При этом, если при пункции получены зрелые яйцеклетки, это не означает, что все они должны нормально оплодотвориться. Наряду с нормальным оплодотворением, в яйцеклетках может быть выявлено отсутствие оплодотворения или признаки того, что яйцеклетка оплодотворена ненормально, т.е. аномально. В последнем случае при осмотре эмбриолог видит в цитоплазме один, три или более пронуклеусов (Рис.4a,b).
Рис.4b

Оплодотворенные подобным образом яйцеклетки изымаются из процесса культивирования в цикле ЭКО с целью предотвращения переноса в полость матки эмбрионов, полученных из них. Данные эмбрионы могут быть использованы только в исследовательских целях, например, для улучшения методик культивирования, а также освоения новых или совершенствования существующих микроманипуляционных техник. Основными причинами аномального оплодотворения является качество яйцеклеток.


5. Оценка дробления (развития эмбрионов)
Через 48 часов после проведения пункции эмбриолог оценивает нормально оплодотворенные яйцеклетки по характеру дальнейшего развития. Данные об особенностях развития (деления) эмбрионов заносятся в специальный эмбриологический протокол. Наиболее распространена класс ификация качества эмбрионов по количеству бластомеров и наличию фрагментов (неправильно делящихся бластомеров), представленная на Рис. 5. Бластомеры эмбрионов отмечены «b», фрагменты «f». Лучший по качеству эмбрион отмечен «1», эмбрион посредственного качества «4». Следует понимать, что внешняя оценка не может говорить о потенциале развития эмбриона на 100%, поэтому даже если эмбрионы имеют удовлетворительное качество, следует делать процедуру переноса эмбрионов, поскольку сохраняются шансы на наступление беременности и последующие роды, хотя эти шансы ниже, чем у эмбрионов отличного качества.

Рис.5

6.Перенос эмбрионов в полость матки (ПЭ)

В большинстве случаев переносу эмбрионов подлежат не более двух эмбрионов категории «1» и/или «2». Эмбриолог под микроскопическим контролем осуществляет набор эмбрионов лучшего качества в стерильный катетер и передает его доктору, проводящему перенос. После процедуры эмбриолог промывает катетер и сообщает доктору, что процедура прошла успешно. Если в результате процедуры ЭКО получено более двух эмбрионов, оставшиеся эмбрионы культивируются до 4-5 суток и в случае соответствия их качества срокам развития могут быть заморожены. Эмбриологические аспекты замораживания эмбрионов более подробно будут рассмотрены в разделе «Замораживание эмбрионов».

ИКСИ – данный метод оплодотворения, в отличие от ЭКО, можно считать «искусственным оплодотворением», поскольку сперматозоид вводится в цитоплазму яйцеклетки с использованием микроинструментов, а выбор сперматозоида осуществляет эмбриолог на основании жизнеспособности сперматозоида (подвижность) и его морфологии (отсутствие видимых внешних нарушений в строении и соотношении различных частей сперматозоида).

Оба вышеуказанных метода оплодотворения – ЭКО и ИКСИ – не имеют доказанных различий по частоте наступления беременности и родов. Как правило, ИКСИ используется при тяжелой форме мужского бесплодия, наиболее часто проявляющейся в существенных отклонениях в спермограмме (олигоастенотератозооспермия), отсутствии сперматозоидов в эякуляте (азооспермия), отсутствии эякулята (аспермия) и ретроградной эякуляции (при этом сперма поступает в мочевой пузырь и выделяется с мочой при мочеиспускании). В случаях азооспермии и аспермии возможно получение сперматозоидов из яичка и придатка яичка хирургическим путем – TESA/PESA. При ретроградной эякуляции сперма собирается после мастурбации путем мочеиспускания в специальный контейнер, а дальнейшая ее подготовка к проведению оплодотворения не отличается от стандартной обработки спермы.

Поскольку ИКСИ является частью программы ЭКО, этапы пункции, обработки спермы, оценки оплодотворения, дробления и переноса эмбрионов проводятся стандартно, как и при ЭКО. Существенные различия отмечаются в подготовке яйцеклеток к оплодотворению и методике оплодотворения, т.к.при ЭКО сперматозоид самостоятельно оплодотворяет яйцеклетку, а ИКСИ – это «введение сперматозоида в цитоплазму яйцеклетки», проводимое эмбриологом с использованием микроманипуляционной техники.

Отличительные этапы процедуры ИКСИ:

1.Подготовка яйцеклеток к оплодотворению.

При подготовке яйцеклеток к оплодотворению используется специальный реактив, содержащий фермент гиалуронидазу. Именно за счет выделения этого фермента сперматозоидами при ЭКО происходит расщепление защитных слоев яйцеклетки (кумюлюса и короны) и проникновение сперматозоида в яйцеклетку. Перед ИКСИ эта процедура выполняется эмбриологом (Рис.1, центр. капля – раствор гиалуронидазы, по кругу – промывочные капли) – яйцеклетки с помощью специальных капилляров в растворе гиалуронидазы очищаются от защитых слоев и оцениваются по стадиям развития . Для ИКСИ отбираются только зрелые яйцеклетки.


2.Оплодотворение – процедура ИКСИ

Процедура ИКСИ выполняется эмбриологом на микроманипуляционной системе, состоящей из микроскопа и высокоточных микроманипуляторов с использованием стерильных одноразовых стеклянных микроинструментов. Перед этим яйцеклетки помещаются в предварительно подготовленные капли среды для ИКСИ, сперматозоиды – в верхнюю каплю с вязким раствором реактива ПВП, позволяющим проводить манипуляции со сперматозоидами максимально безопасно (Рис .2, вид сверху - чашка для проведения процедуры ИКСИ). Капли сверху покрываются минеральным маслом, что позволяет поддерживать стабильные условия при проведении процедуры (поддержание температуры и стерильности). Перед введением сперматозоида необходимо его обездвижить и поместить в полость микроиглы (Рис.3, слева), затем перевести микроиглу в каплю с яйцеклеткой, с помощью присоски зафиксировать яйцеклетку. После этого подвести микроиглу к яйцеклетке. Сперматозоид подвести внутри иглы к оболочке и произвести введение сперматозоида в цитоплазму, после чего вывести микроиглу из яйцеклетки (Рис.3, справа). Как отмечалось выше, при процедуре ИКСИ важен этап отбора

Схема оплодотворения – процедура ИКСИ
Схема оплодотворения – процедура ИКСИ
Схема оплодотворения – процедура ИКСИ
Схема оплодотворения – процедура ИКСИ

«качественного» сперматозоида, поэтому осмотр сперматозоидов на отсутствие морфологических (внешних) дефектов эмбриолог проводит при максимальном увеличении микроскопа (увеличение в 400 раз), а сама процедура ИКСИ проводится при 200-кратном увеличении. После процедуры яйцеклетки переносят в чашку для культивирования, каждую в отдельную каплю со «средой оплодотворения», и помещают в инкубатор. Последующие этапы (оценка оплодотворения, дробления и перенос эмбрионов) проводятся так же, как и при процедуре ЭКО.

Вспомогательный хетчинг (ВХ) – суть данной процедуры заключается в частичном рассечении или удалении оболочки эмбриона.

ВХ может быть выполнен тремя способами:

  • Механический способ – рассечение части оболочки эмбриона с помощью микроинструмента (стеклянного микроскальпеля)
  • Химический способ – удаление части оболочки эмбриона путем воздействия химического раствора, имеющего повышенную кислотность (наиболее часто используется кислый раствор Тироде).
  • Лазерный способ – удаление части оболочки эмбриона воздействием микроимпульса диодного лазера.

Показаниями для проведения данной процедуры могут быть:

  • Видимые изменения в толщине оболочки эмбриона
  • Возрастной фактор (при этом могут быть невидимые изменения свойств оболочки эмбриона без внешних изменений в ее толщине)
  • Повышенный базальный уровень ФСГ
  • Проведение преимплантационной генетической диагностики (ПГД)
  • Многократные неудачные попытки переноса эмбрионов хорошего качества без наступления беременности

ВХ независимо от способа выполняется с использованием микроскопа, позволяющего оптимально оценить качество процедуры. Ниже ( Рис. 1,2 ) представлена процедура проведения ВХ химическим способом. При этом раствор Тироде набирается в микроинструмент (Рис.1, справа, Рис. 2, слева) а эмбрионы помещаются в капли среды для ВХ (Рис.2). Эмбрионы фиксируются удерживающей присоской (Рис.1, слева), микроинструмент подводится к оболочке (Рис.2, справа вверху) и раствор изливается из него под давлением до момента разъедания оболочки эмбриона (Рис.2, справа внизу). При этом размер участка удаленной оболочки не должен превышать 50 микрометров.

При проведении преимплантационной генетической диагностики (ПГД) вспомогательный хетчинг является первым этапом для получения бластомера эмбриона. Более подробно процедура ПГД будет рассмотрена в отдельно в разделе «Преимплантационная генетическая диагностика». Также, в нашей лаборатории проводится ВХ с удалением фрагментации в эмбрионах (ВХ+УФ). Детально особенности этой процедуры будут рассмотрены в разделе «Вспомогательный хетчинг с удалением фрагментации».

Криоконсервация эмбрионов

Если при проведении процедуры ЭКО удается получить больше эмбрионов, чем необходимо для одной подсадки, по желанию пары их можно сохранить при очень низкой температуре - провести криоконсервацию оставшихся эмбрионов. Эти эмбрионы являются собственностью пары и могут быть использованы в дальнейшем для следующей попытки или следующей беременности.

Преимущества, которые дает программа криоконсервации эмбрионов:

  • Повышение индивидуальной вероятности успешного преодоления бесплодия за счет повторных переносов эмбрионов
  • Женщина избегает процедуры стимуляции и пункции фолликулов и готовится только к подсадке. Подготовка эндометрия проводится с помощью таблеток и нескольких ультразвуковых исследований.
  • Уменьшение числа индукций суперовуляций и снижение затрат пациентов, связанных с приобретением лекарств.
  • Предупреждение тяжелых форм синдрома гиперстимуляции яичников (СГЯ). В случае высокого риска развития СГЯ в стимулированном цикле перенос эмбрионов не проводится, а все эмбрионы замораживаются.

Сосуд Дюара для хранения замороженных эмбрионов

Криоконсервация является некоторой "биологической поддержкой" для пары: нельзя точно предсказать, будет ли успешной стимуляция и оплодотворение при возможной следующей попытке. Сохраняя оставшиеся эмбрионы, пара увеличивает свои шансы. Криоконсервация дает пациентам также и некоторую экономическую уверенность - стоимость хранения, разморозки и подсадки почти на порядок ниже, чем "свежей" попытки ЭКО.

Криоконсервация – это надежный и проверенный метод. Никаких отрицательных влияний на плод и течение беременности, связанных с криоконсервацией, не выявлено.

Недостатком является возможная потеря эмбрионов в процессе заморозки и разморозки - не все эмбрионы сохраняют жизнеспособность. Очень важно, чтобы преред началом подготовки к процедуре ЭКО Вы обсудили с лечащим врачом необходимость заморозки Ваших ”лишних” эмбрионов

Благодаря криоконсервации эмбрионов лечение становится более щадящим

Первая беременность после переноса замороженных, затем размороженных эмбрионов была получена в 1983 году, а первые роды произошли в 1984 году. Следует отметить, что замораживание/размораживание переносят далеко не все эмбрионы. Потери эмбрионов в этой программе достигают 50%. Никогда нельзя сказать заранее будут ли размороженные эмбрионы дальше развиваться. Замораживание эмбрионов возможно на любых стадиях их развития. Выбор стадии замораживания зависит от многих факторов и определяется эмбриологом и врачом индивидуально.

Эмбрионы могут быть разморожены и перенесены в полость матки в естественном менструальном цикле в случае неудачной попытки ЭКО или, если попытка была удачной и беременность наступила, таким путем может быть получена новая беременность. Хранение эмбрионов может продолжаться не более 5 лет. Конкретный срок хранения устанавливается пациентами в виде письменного заявления и должен быть оплачен. Хранение может быть прекращено прежде установленного срока по письменному заявлению пациентов или по истечению установленного срока при отсутствии письменного заявления о продлении хранения или неоплаты этой услуги.

Степень риска развития врожденных пороков развития у детей из размороженных эмбрионов до сих пор точно не определена. Однако, хорошо известно из многолетней мировой практики использования криконсервации эмбрионов в животноводстве - замораживание/размораживание эмбрионов не приводит к увеличению частоты врожденных дефектов у потомства. Накопленный на сегодня в мире опыт также свидетельствует об отсутствии различий в частоте этой патологии у детей, родившихся в результате спонтанных беременностей и из размороженных эмбрионов.

ПРЕИМПЛАНТАЦИОННАЯ ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА

Преимплантационная генетическая диагностика – метод определения наиболее часто встречаемых генетических аномалий в эмбрионах до переноса их в полость матки.

Цель ПГД – получение беременности здоровым плодом

Для достижения этой цели мы решаем следующие задачи:

  • Уменьшение риска рождения ребенка с генетической аномалией у носителей и больных генными или хромосомными заболеваниями.
  • Увеличение эффективности ЭКО/ИКСИ методом исключения использования при ПЭ эмбрионов с численными аномалиями кариотипа.
  • Определение пола эмбриона для предотвращения передачи заболевания, сцепленного с полом.При этом наша клиника считает неэтичным определение пола «по желанию», выполняя рекомендации этического комитета ESHRE (Европейской Ассоциации Репродукции и Эмбриологии)

Принцип ПГД

Принцип ПГД - выявление генетических нарушений у эмбрионов перед их переносом в полость матки. После проведения данной процедуры переносу в полость матки подлежат только те эмбрионы, в которых определяемые нарушения отсутствуют или находятся в сбалансированном состоянии.

Показания к проведению ПГД

  • Носительство хромосомных перестроек
  • Три и более спонтанных прерываний беременности на ранних сроках («earlypregnancyloss»)
  • Более двух-трех неудачных попыток IVF/ICSI
  • Возраст женщины старше старше 35 лет («advancedreproductiveage»)
  • Тяжелые нарушения сперматогенеза

Этапы проведения ПГД

  • Вспомогательный хетчинг
  • Биопсия бластомера эмбриона (Рис.1 – 4)
  • Анализ полученного

После проведения всех этапов ПГД эмбрионы с отсутствием хромосомных нарушений культивируются в течение двух суток и переносятся в полость матки на стадии бластоцисты.